专业微整培训班介绍PRP在自体脂肪移植中的应用

 

    对于整形外科医生和患者来说，解决容量缺失越来越重要。容量缺失可以通过多种方法纠正，包括组织重新定位(如面部提升)、假体植入、合成填充剂(如透明质酸)或自体组织移植。自体脂肪移植技术最早于20世纪初兴起。该技术经科尔曼标准化后，已广泛应用于整形美容外科领域。脂肪移植物作为软组织填充物广泛应用于隆胸手术、下肢萎缩[1]、凹陷性瘢痕[2]等。它不仅具有良好的组织相容性，而且使用方便、易得、经济实惠。它最先应用于面部美容手术，近年逐渐用于手部（4）。注射的脂肪除了有矫正容量缺失的效果外，还能促进新血管生成（5），改善皮肤弹性，对抗衰老。该技术同时也可促进伤创面愈合、瘢痕及放射性皮炎治疗和改善痤疮瘢痕（6-8）。近年脂肪移植在乳房重建和隆乳中应用也愈发广泛（9）。

 

    脂肪移植的主要优点包括：(a)持久且相对稳定的效果;(b)可避免肉芽肿和永久性注射物可能引起的过敏反应;(c)天然的一致性;(d)为注射区域皮肤和皮下组织提供营养支持。

 

    脂肪移植成功的关键源自丰富的再生多能干细胞，特别是脂肪来源干细胞（Adipocytic derived Stem Cells，ADCs）。这些全能干细胞整合到宿主组织，精准分泌各种细胞因子和生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF),血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGFβ)（3）。

 

    虽然脂肪移植存活率和远期效果部分受适应症选择和患者基础条件影响，但外科技术影响最大。但即便最先进的技术手段，移植后脂肪组织的部分不可控吸收(10%到90%)使远期保留率不稳定，导致患者满意度不高，限制了脂肪移植更广泛的应用（2）。迄今提出的提高脂肪移植效率最为有效手段是使移植组织中富含间充质干细胞，但大多数报道耗时，昂贵且使获取的脂肪严重丢失，疗效仍存在不确定性；另一种提高脂肪移植效果的方法是通过生长因子刺激移植组织再生存活，但外源性和合成生长因子治疗在临床(如创面治疗等)中并没有取得预期的效果。其中一个原因就是蛋白质的脆弱和生长因子的不稳定性。

 

    目前，最常用的脂肪收集、纯化和渗透是Coleman在1986年详细描述的方法，考虑了脂肪细胞在处理过程中的脆弱性。因此，我们建议增加自体富血小板血浆(PRP)-众所周知的生长因子自然存储库，促进干细胞存活，增殖和分化，以提高脂肪移植后远期保留率和疗效。

 

    影响移植脂肪成活率的因素

 

    01、供受区的选择

 

    脂肪组织丰富的部位均可作为供区，脂肪移植手术吸脂量相对单纯吸脂手术要少，对质量要求较高。临床中最常用的供区是大腿后外侧，因为此处纤维少且属于相对无血管区。但脂肪可从任何部位获取，包括腰腹部和上臂内侧，取决于患者/医生的偏好。关于供区选择和脂肪移植效果之间的关联，还没有足够令人信服的证据（14)。但有学者认为脂蛋白酶（lipoproteinlipase，LPL）高的供区移植成活率高，其中臀部和大腿最高，下腹部其次。受区应选择血供好的部位及层次进行少量多层次移植，利于脂肪存活。

 

    02、吸脂方式的选择

 

    移植脂肪成活率也取决于吸脂时对脂肪细胞的损伤程度。Shiffman比较了不同规格的注射器和套管针在不同负压下吸脂对脂肪细胞活性的影响，结果显示脂肪细胞在

 

    -700mmHg负压下活性显著下降，而低于-500mmHg负压下吸取的脂肪细胞活性较好（19），脂肪细胞活性随吸脂时负压的增加而降低（15）。因此，应避免机械吸脂(大于-500mmHg)，只有手动吸脂采集才能获得满意的脂肪移植物质量（16）。用10ml螺口注射器连接钝头套管针将活塞拉至2ml产生的低负压所获取的脂肪质量最优。套管针直径小于18G显著会增加对脂肪细胞的损伤（19）。最常用的是钝头套管针直径为3mm。

 

    03、脂肪的分离与纯化

 

    理想的脂肪纯化方法是将血液、肿胀液和细胞碎片及脂滴从健康的脂肪细胞中分离出来。虽然学者们描述了各种分离脂肪的方法，但没有一种被确定优于其他方法；但普遍认为，操作步骤越少的技术可能会有更好的结果，包括：（a）静置沉淀法:含脂肪混悬液静置30分钟到1个小时,依靠各组分密度差异自然分层，该法避免脂肪暴露在空气中，适合少量移植或在缺乏层流手术室的机构采用，目前已有适合大量移植的无菌采脂袋，提高采集效率；(b)吸附法:操作简单快捷，适合少量移植；(c)清洗过滤法:在无菌杯上覆盖无菌纱布，获取的脂肪放在无菌纱布上,用乳酸林格氏液冲洗，待其自然滤干，适合大容量移植，但脂肪暴露时间较长，应在层流手术室内操作；(d)机械离心法:将脂肪低速离心，1200g*3分钟。该方法将脂肪从加速降解的物质中分离出来，浓缩单位体积内移植物脂肪细胞和干细胞数目，但对无菌条件要求较高。各种研究评估了机械离心对脂肪移植的影响，大多研究得出结论：离心不会对脂肪细胞的存活力产生负面影响，除非转速或离心力过高（17）。

 

    04、注射方式的选择

 

    提纯的脂肪应尽快注射，不应超过半小时；如脂肪离体超过4小时，或冷藏（冻）保存后，其活力显著下降。Coleman等人建议应多解剖层次多隧道分散少量注射，以增加脂肪移植物表面积与受区的比例，并采取边退针边注射脂肪，注射完轻柔按摩抚平，禁用力按压。在脂肪移植过程中，注射时引起的机械损伤和血供中断引起的缺血损伤使移植物存活率降低，并引起液化、坏死等并发症（23，24）。脂肪颗粒与注射针管径差异越大，脂肪在注射时受到的形变压力越大，损伤越明显，因此操作时尽量选择与脂肪颗粒大小匹配的注射套管针。对于小而精确的脂肪移植(如眶下区域)，我们建议使用1.65mm套管针。

 

    PRP与脂肪移植

 

    移植后48h内，受区的脂肪移植物出现再血管化，在此之前，它由血浆中的游离物质提高营养。失活组织则被巨噬细胞清除，纤维化和囊性变。移植物的成活质量高度依赖于愈合进程、再血管化和成脂分化。脂肪细胞存活率在文献报道上有很大差异，归因于不同脂肪细胞收集、加工和再注射技术的差异（前文已叙述）。

 

    对于再注射前处理纯化后脂肪的最佳方法，学者们尝试各种方法提高移植脂肪的存活率，如加入胰岛素，肝素，钙离子，甲状腺素，人血白蛋白，生长因子，SVF（基质血管片段）及PRP等，目前还没确凿的证据确定上述任一方法优于其他方法并得到学界广泛认可。

 

    PRP不仅含有高浓度血小板和凝血因子，可有效止血，还在移植部位以生物学确定的比例释放天然生长因子，如血小板来源生长因子（PDGF），转化生长因子（TGF-β），表皮生长因子（EGF），血管内皮生长因子（VEGF）及成纤维细胞生长因子（EGF）。释放的生长因子刺激成纤维细胞和血管内皮细胞等多种组织细胞的增殖与分化，促进血管生成，促进胶原纤维和粘连蛋白等胞外基质的表达，抑制其降解以促进三维基质的重建，使脂肪细胞重新排列成正常的三维组织。此外，PRP含有大量白细胞，有利于预防感染。

 

    这种方法完全是自体的，不需要任何形式的体外预适应或培养基补充就能独立使用。基于PRP的特性，将PRP与脂肪移植物混合进行再注射，可在受区早期快速建立血供。在一系列体外研究中，已证实PRP可以提高脂肪细胞存活率和干细胞分化（10，11）。Dong将PRP和脂肪混合物注射入裸鼠头颈部，发现PRP可以提高移植体10周后的存活率。有几例临床病例报道了脂肪移植与PRP联合应用可促进创面愈合（12）。由于普通脂肪颗粒直径较大，这些移植物只能作为深层组织容量填充剂（21）使用。Tonnard（22）发现并报道了纳米脂肪Nanofat，它可以克服这一限制。Nanofat含有大量的SVF和ADSCs，不仅可以作为一种浅表的真皮内填充材料，还可以促进组织再生。LEI(25)在小鼠模型中探索并比较了以1:4的比例PRP/fat和PRP/nanofat与移植物存活和血管化的关系。得出结论：PRP可促进纳米脂肪和脂肪移植物的存活率和再血管化。脂肪移植和PRP联合应用于面部重建同样有一些成功案例（13）。但最新的研究报道称，在临床应用模型(将获取的脂肪与PRP混合后再注射移植)中，PRP可增加炎症反应，促进坏死组织吸收和肉芽组织增殖;然而，PRP不能增加活脂肪细胞数量。最重要的原因可能是脂肪移植物缺乏血管基质成分SVF和ADSCs。进一步的研究应集中在往移植物中添加SVF和ADSCs能否增强PRP正向促进效果（20）。一项动物研究（26）利用三维CT分析脂肪移植物体积随时间的变化，结果显示非活化prp与脂肪移植物的结合显著提高了脂肪细胞的存活率和组织的血管密度。然而，与其他添加激活prp的研究相比，非激活prp直到第90天才增加残余脂肪移植物体积。目前关于PRP对于脂肪移植疗效的研究结果存在争议可能是因为不同的PRP应用方法,包括混合模式,PRP和脂肪的体积比,PRP中血小板的浓度,激活PRP的方案,活化剂的选择都存在差异。统一和优化评价参数与计算方法，对于获得客观、真实的结论具有重要意义，因此PRP的最佳应用方案有待进一步研究。虽然在该模型中发现PRP/nanofat治疗很有前景，但其治疗效果可能因环境而异，因此应该在其他应用中进行探索。此外，还需要探索和规范不同应用条件下Nanofat-PRP的最佳配比和制备方法。

 

    PRP的制备

 

    市面上制备prp的方法很多，不同的离心次数，离心力和离心时间制作PRP中血小板浓度，活性和回收率各不相同。在美国，已接受FDA认证并商业化生产的PRP制备装置达10余种，目前在国内市场除“威高PRP套装”等少数几个制备系统外，大多数是手工简易制备。但无论设备自动化制备还是手工制备，原理是相似的：根据血液离心过程中沉降速度的差异，首次离心后，全血分为三层：上层为上清液，中层为富含血小板层，下层为红细胞。

 

    目前主流的PRP制作方法是二次离心技术。它相较一次离心技术可获得更高的血小板回收率。但迄今文献报道该法的离心力及离心时间差异较大，未达成临床共识。张长青比较了四种PRP制作方法（已证实含有高浓度血小板）在血小板计数，回收率和血小板活化率之间差异（27）（表一）。

 

    由上表可见，四种制作方法中，只有Anitua法一次离心，所得血小板计数和回收率明显低于其它三种方法。二次离心法中Petrungaro 法首次离心力大于Landesberg 法和Aghaloo 法，但PRP 中血小板计数和回收率却小于后两者。而在红细胞下层，Petrungaro 法的血小板计数最高，这一部分在首次离心后被弃掉，这也是Petrungaro 法血小板回收率低于Landesberg 法和Aghaloo 法的原因之一。同时提示：如以较大离心力离心制作PRP，可以在交界面（上清层与红细胞层之间）以下取较多的红细胞层。Landesberg 法和Aghaloo 法在交界处的血小板浓度较高，以交界面以下最高，交界面上其次。

 

    最佳离心时间需综合多种因素考虑，这有待进一步的研究。Landesberg 法和Aghaloo 法的离心时间，两次均10分钟，血小板的回收率高，是较理想的离心时间。此外，血小板在体外很脆弱，容易激活，在其它条件一致的情况下，离心力过大，时间过长，和离心次数过多都会导致血小板活化率的升高。这也是 Petrungarot 法和Aghaloo 法血小板活化率高的原因。

 

    目前国内已上市的“威高PRP套装”包括：三孔离心管，分别为通气孔a(过滤膜能过滤空气)、中间吸管孔b(抽取PRP和下层红细胞)、右侧离心管孔c(抽取上清液)，使所有接触血液的操作都在离心管内，降低了二次污染和血小板激活的几率（图1）。

 

    制备过程：用预先装有5ml枸橼酸钠抗凝剂的50ml 一次性注射器以18g针头经肘前静脉取血45ml（图2）。轻轻摇匀，吸取40ml注入PRP套装离心管中，严格无菌状态下制备PRP。首先2000rpm(约650g)离心10min（图3），试管里的全血分为3层，上层是上清液，下层是红细胞，两层交界处可见一很薄的浅黄色层，即PRP层。打开离心管a孔通气，20ml注射器连接离心管中间b吸管孔，吸取下层的红细胞约16ml(图4)。将剩余的约24ml血液继续2000rpm离心10min。可见在底部薄层的红细胞表面沉积有白膜样物质，即为血小板和白细胞沉积层;其上部为透明的贫血小板血浆层PPP。再次打开通气孔，注射器连接无菌吸引管经离心管的右侧吸引c孔，吸取上部大部分血浆，使离心管中剩约4ml（图5）。静置片刻后振荡离心管约5分钟，使血小板充分重悬于剩余的血浆中，即得到PRP（27）。

 

    术前麻醉

 

    01

 

    局麻药的配制

 

    0.9%氯化钠注射液10ml+2%盐酸利多卡因卡因注射液10ml（200mg）+1%盐酸肾上腺素注射液0.1ml；

 

    02

 

    肿胀液的配制

 

    0.9%氯化钠注射液500ml+2%盐酸利多卡因卡因注射液15ml（300mg）+1%盐酸肾上腺素注射液0.5ml；

 

    肿胀液对脂肪细胞有一定的破坏，因此以移植为目的的吸脂手术肿胀液注射量要比常规吸脂手术少，一般以拟吸脂量的1.5倍为宜(表二)。对于小范围面部脂肪移植，可采用局部浸润（肿胀）麻醉，局部神经阻滞（眶上孔，眶下孔，颏孔）也能有效缓解疼痛。在额颞部等血供丰富部位及层次填充时，预先行肿胀麻醉也能有效收缩小血管，减少术中出血及栓塞风险。如手术范围广泛或手术时间较长，可加行静脉复合麻醉。

 

    切口的选择

 

    供区切口根据吸脂部位而异，以隐蔽，方便操作为原则，常选择以下几种：

 

    1.臀股沟切口适合大腿内，外，后方部位的吸脂；

 

    2.脐周切口适合上下腹部范围的脂肪吸取，切口隐蔽，愈合后痕迹小；

 

    3.髂前上棘切口适合上下腹部及侧腰部范围的脂肪吸取，切口愈合后痕迹可被裤头遮盖，相对隐蔽；

    脂肪的获取及纯化

 

    患者行全身麻醉及供区肿胀麻醉后，使用2.5mm内径的多孔吸脂针接20ml螺口注射器手动低负压多隧道均匀吸取脂肪，吸取的脂肪混悬液经密闭硅胶管转入一次性采血袋中（图6），经静置沉淀后，将下层肿胀液，血液及细胞碎片排出废弃，袋中的脂肪分装入20ml螺口注射器中（图7），特制堵头封闭后放入离心套管中，按照Coleman技术标准：1200g离心3min（图8），整个操作过程严格遵循无菌原则，获取的脂肪组织在密闭腔隙中转移，未暴露在空气中，这也大为降低了术后感染，液化坏死等并发症发生概率，有利于移植物存活。

 

    离心后注射器内分为三层（图9）：将最上层的油倒出，将最下层肿胀液等挤出注射器。中间层主要由脂肪移植物组成（从下往上可相对分为高，低两种密度的脂肪组织）；一般提取下半部分高密度脂肪作为软组织凹陷的容量填充；而上半部相对较低密度脂肪经过机械乳化（图10）：两螺口注射器经1.4mm 内径的乳化头连接，以10mL/s的速率将管内的低密度脂肪来回推注以充分乳化（10-15次），乳化后的脂肪经500um孔径滤网过滤后再次离心：2000g离心3min，离心后弃除上方油层得到基质血管成分SVF-gel（图11），其含有大量SVF和ADSCs。因此，使用不同内径及侧孔径的吸脂针，不同纯化手段（如乳化）获取的脂肪颗粒大小，性状及生物学特性存在较大差异，故应用范畴也不同（图12，13）。

 

    最新研究报道证实称PRP可增加脂肪移植后炎症反应，促进坏死组织吸收和肉芽组织增殖;然而，PRP不能增加活脂肪细胞数量。最重要的原因可能是脂肪移植物缺乏血管基质成分SVF和ADSCs；因此，我们认为在首次离心制备的高密度脂肪中同时添加SVF-gel和PRP不仅能提供移植物成活及再生所需的SVF和ADSCs，还能释放多种生长因子刺激成纤维细胞和血管内皮细胞等多种组织细胞的增殖与分化，促进血管生成，促进胶原纤维和粘连蛋白等胞外基质的表达，抑制其降解以促进三维基质的重建，使脂肪细胞重新排列成正常的三维组织。

 

    PRP与脂肪混合

 

    通过三通连接器将离心纯化的高密度脂肪，提取的SVF-gel和20%等体积的PRP混合。根据体外研究，80%的脂肪/20%的PRP似乎是细胞增殖和存活的最佳体积比。混匀的脂肪与prp混合物建议在半小时内注射入体内。